TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
—-o0o—-
GIỚI THIỆU QTL VÀ BẢN ĐỒ QTL VỀ DI TRUYỀN TÍNH CHỐNG CHỊU KHÔ HẠN
BÁO CÁO KHOA HỌC
Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học Các học viên thực hiện
PGs. Ts.Nguyễn Thị Lang Trần Quang Thái Duy
Nguyễn Lê Anh Đào
Lê Kim Hiển
Nguyễn Văn Mít
Hồng Phúc Ngươn
NĂM 2010
MỤC LỤC
1. Giới thiệu về QTL.. 3
1.1 Định nghĩa. 3
1.2 Cơ sở di truyền về QTL.. 3
1.3 Bản đồ QTL.. 4
1.4 Marker phân tử trong lập bản đồ QTL.. 5
1.5 Sử dụng quần thể trong phân tích phối hợp QTL/marker. 6
1.6 Phương pháp tính để phát hiện sự phối hợp marker/QTL.. 7
1.7 Phân tích QTL.. 7
1.7.1 Những mô hình về di truyền số lượng. 8
a. Mô hình QTL đơn (single-QTL). 8
b. Mô hình “multiple-locus”. 9
1.7.2. Các phương pháp phân tích Marker. 9
a. Phương pháp phân tích marker đơn (SMA = single marker analysis). 9
b. Phương pháp SMA trong quần thể F2. 12
1.7.3 Phân tích QTL trên cơ sở bản đồ cách quãng (interval mapping). 13
a. Bản đồ cách quãng trong quần thể hồi giao (BC). 13
b. Bản đồ cách quãng trong quần thể F2. 15
1.7.4 Khả năng giải thích về thống kê sinh học của bản đồ QTL.. 15
2. Cơ sở di truyền tính chống chịu khô hạn. 18
2.1 Khô hạn. 18
2.2 Phương pháp nghiên cứu về di truyền tính chống chịu khô hạn. 19
2.3 Xác định tính trạng thành phần trong chống chịu khô hạn. 20
3. Bản đồ QTL các tính trạng hình thái quan trọng của cây chống chịu khô hạn. 23
3.1 Bản đồ QTL đối với tính trạng rễ lúa. 23
3.2 Bản đồ QTL đối với tính trạng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA). 25
3.3 Bản đồ QTL tính trạng biểu hiện màu xanh của cao lương. 27
3.4 Bản đồ QTL đối với các tính trạng hình thái quan trọng khác. 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO.. 33
GIỚI THIỆU QTL VÀ BẢN ĐỒ QTL VỀ DI TRUYỀN TÍNH CHỐNG CHỊU KHÔ HẠN
1. Giới thiệu về QTL
1.1 Định nghĩa
Di truyền tính trạng số lượng QTL (Quantitative trait loci) là sự định vị của gen có ảnh hưởng lên một tính trạng được đo lường trên một phạm vi số lượng.
Dựa vào công thức sau:
P= µ + G + e = µ + a +d + i + e
ü QT: Tính trạng số lượng (tính trạng thể hiện sự phân bố chuẩn, liên tục trong quần thể lớn và chưa qua chọn lọc nào).
ü P: Đánh giá kiểu hình (sự đo lường hiệu quả của các cá thể).
ü G: Ảnh hưởng kiểu gene (ảnh hưởng của yếu tố di truyền, kiểm soát kiểu hình, được đo lường thông qua độ lệch với giá trị trung bình quần thể).
ü a: Ảnh hưởng tính cộng (một phần của ảnh hưởng môi trường).
ü d: Độ lệch tính trội (ảnh hưởng kiểu gene không có sự tham gia của [a], ảnh hưởng tương tác giữa hai alen trong cùng locus).
ü i: Epistasis (ảnh hưởng tương tác giữa 2, 3 hay nhiều loci).
ü e: Sai lệch trong liên kết [ Linkage disequilibrum] (các loci không thể kết hợp ngẫu nhiên để tạo ra sự tăng, hoặc giảm kiểu gene nào đó, do sự liên kết quá chặt hoặc yếu tố khác, so với trường hợp nó không liên kết. Mức độ sai lệch trong liên kết được xác định bằng mức độ liên kết, sự chọn lọc,vv…).
1.2 Cơ sở di truyền về QTL
Thí dụ trong cặp lai : MMTT x mmtt
Trong đó: M/m là hai alen của locus có tính chất marker
T/t là hai alen của QTL.
Chúng ta giả định rằng có một giá trị liên kết r giữa M và T trên nhiễm sắc thể chúng hiện diện. Trong F2, nếu r = 0.5, thì sẽ có một tái tổ hợp tự do [free recombination]. Tất cả các kiểu gene của F2 đều có thể xuất hiện theo tỷ lệ mong muốn.
Nếu r = 0 thì MMTT= 0,25; MmTt = 0,50; Mmtt = 0,25
Do đó sự phân loại các alen có tính chất marker sẽ tạo ra kết quả phân loại QTL alen, và hiệu số giữa các giá trị trung bình các lớp sẽ là: Mm-mm=2a(1-2r). Khả năng khám phá sự phối hợp QTL/marker tùy thuộc vào cả hai giá trị r và a.
1.3 Bản đồ QTL
Bản đồ QTL (quantitative trait loci) được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (thí dụ như tính chống chịu mặn). Di truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những loci riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen khác. Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng marker phủ trên toàn bộ nhiễm thể trong genome cây trồng sẽ cung cấp cho chúng ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gen trên những nhiễm thể, và xác định các gen mục tiêu liên kết với gen khác.
Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của những tính trạng số lượng bằng cách xác định số lượng, các vị trí, những ảnh hưởng của gen, và hoạt động của những loci bao gồm tương tác gen (epistasis) và tương tác QTL x E (môi trường). Một mục đích khác của bản đồ QTL là xác định những marker mang tính chẩn đoán đối với những kiểu hình đặc thù nào đó, sao cho việc áp dụng MAS trở nên có hiệu qủa, phục vụ yêu cầu chọn dòng (giống) chống chịu khô hạn, chống chịu mặn, v.v.. Mục tiêu lâu dài của thí nghiệm về bản đồ QTL là “cloning” các gen điều khiển tính trạng số lượng vô cùng phức tạp, thông qua tiếp cận kỹ thuật “map-based cloning” (Li 1999).
Nguyên tắc lập bản đồ QTL với marker phân tử DNA là phát hiện cho được những kết hợp giữa marker và tính trạng trên cơ sở liên kết gen, thông qua các phương pháp bố trí thí nghiệm và phương pháp phân tích thống kê chính xác. Quần thể phục vụ cho những yêu cầu như vậy thường là: F2, hồi giao (BC), đơn bội kép (DH), hoặc cận giao tái tổ hợp (RIL) từ một tổ hợp lai giữa hai dòng cận giao, phân ly những tính trạng số lượng mục tiêu và nhiều marker đi kèm theo. Quần thể này phải được đánh giá kiểu hình rất đầy đủ, và được đánh giá kiểu gen thông qua bản đồ liên kết gen với mật độ marker phủ trên nhiễm thể dày đặc.
Các phương pháp phân tích thống kê phải đáp ứng yêu cầu chính xác, đáng tin cậy, thông quan phân tích từng marker đơn, phân tích bản đồ cách quãng, và mô hình tuyến tính.
Cho đến nay, người ta biết rằng QTL ảnh hưởng nhiều tính trạng nông học quan trọng. Những QTL này đóng vai trò ảnh hưởng chính (tính cộng và/hoặc tính trội), chúng được tìm thấy thông qua mô hình “main-effect QTL” được mô tả bởi Lander và Botstein (1989), Zeng (1994), Li (1999).
Mô hình “main-effect QTL” có những đặc điểm cơ bản như sau:
ü Những gen chủ lực phải có ảnh hưởng đến tính trạng di truyền cao, chúng được xem như những QTL có ảnh hưởng lớn (giá trị LOD score phải lớn) và có tính chất xác định rõ ràng thông qua quần thể và môi trường
ü Những QTL mẫu phải có ảnh hưởng chính khá nhỏ và đại diện cho hơn 80% loci được nhận dạng trong genome cây trồng
ü Những thí nghiệm MAS đối với nội dung chuyển các QTL mong muốn để cải tiến tính trạng số lượng phải được thực hiện với sự thận trọng nhất định. Bởi vì tương tác giữa QTL với môi trường, hiện tượng epistasis cần phải được giải thích
Hiện tượng epistasis và sự kiểm soát biến dị di truyền đã được đề cập trong các mô hình cải tiến. Bên cạnh đó tương tác QTL x E cũng đuợc thảo luận.
1.4 Marker phân tử trong lập bản đồ QTL
Những loại marker phân tử chính thường được sử dụng là:
ü RFLP là marker có tính chất đồng trội (co-dominant) và rất đáng tin cậy. Kỹ thuật này sử dụng cDNA hoặc thể probe, được đánh dấu bằng phóng xạ, và sự phân cắt hạn chế của enzyme
ü RAPD là một dạng marker DNA được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR. Mức độ khuếch đại cao từ một cặp mồi đơn giản, ngắn, được thiết kế ngẫu nhiên (10 mer). Đây là marker có tính trội (dominant) và mức độ tin cậy thấp
ü STS là marker được thiết kế từ chuỗi ký tự của RFLP (20-24 mer), có tính chất đồng trội, được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR, đôi khi nó cũng thể hiện tính trội. Đây là phương pháp có thể phải sử dụng enzyme phân cắt trong trường hợp sự đa hình khôngthể hiện rõ. Kết qủa có độ tin cậy tốt.
ü Microsatellite hoặc SSR là marker được thiết kế từ những vệ tinh có chuỗi ký tự giản đơn, lập lại nhiều lần. Cặp mồi được thiết kế từ trước và sau những vệ tinh như vậy. marker có tính chất đồng trội, mức độ tin cậy cao, khả năng dò tìm đa hình khá nhạy. Do đó, nó đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD với các mô típ “di-nucleotide” hoặc “tri-nucleotide” (GA, GT, CAT, CTT) trong genome cây lúa
ü AFLP là một dạng trong những marker dựa trên cơ sở PCR, theo cách chọn lọc của hai “adaptor” (là những enzyme phân cắt hạn chế). Nó phối hợp cả hai tính chất của RFLP và RAPD, nên có khả năng phát hiện đa hình rất tốt. Nhưng nó thường có tính chất trội (dominant) nên gặp hạn chế khi thể hiện alen lặn
Những marker phân tử nói trên đều có thể được áp dụng trong bản đồ QTL để nghiên cứu tính chống chịu khô hạn của genome cây lúa. Hướng ưu tiên hiện nay được người ta quan tâm là sử dụng microsatellite (SSR).
1.5 Sử dụng quần thể trong phân tích phối hợp QTL/marker
Bất cứ cấu trúc quần thể nào cũng có thể sử dụng phân tích phối hợp QTL /marker. Loại quần thể thường được sử dụng là:
ü Cây F2 của tổ hợp lai giữa hai đồng hợp tử
ü Dòng F3 của những cá thể F2
ü BC1
ü Dòng đơn bội kép [DH]
Loại hình khác như: tổ hợp lai/quần thể cũng có thể được sử dụng. Người ta dùng lai diallel để lập bản đồ có tính chất ưu thế lai[dị hợp tử ]. Lai thử nghiệm [testcross] cũng được khuyến cáo. Con lai từ những cặp lai của một quần thể [diallel] cho đến con lai đã ổn định sau quá trình cận giao đã được phân tích.
Quy mô quần thể cũng phải đủ lớn. Chúng ta phải gặp những trở ngại sau đây:
ü Quần thể càng lớn, giá thành càng đắt, thí dụ quần thể DH.
ü Chi phí để tính toán giá trị kiểu hình.
ü Chi phí để tính toán kiểu gene.
Theo các nghiên cứu gần đây, người ta sử dụng các quần thể có quy mô từ 150 đến 300 cá thể .Tuy nhiên theo Stubber và ctv.(1992) đã cho rằng quy mô quần thể nhỏ sẽ không mang lại kết quả chính xác,và không đủ điều kiện để xác định sentayho.com.vnêu chuẩn IRRI hiện nay là 200-300 cá thể của F2 và quần thể RI. Muốn có bản đồ marker tốt ,và tránh hiện tượng liên kết giả (pseudo linkage ) chúng ta phải có một quần thể không sai lệch quá đáng với bố mẹ.
1.6 Phương pháp tính để phát hiện sự phối hợp marker/QTL
Các phương pháp sau đây dùng để phát hiện sự phối hợp marker/QTL
ü Phân tích tuyến tính dạng đơn
ü ANOVA một chiều
ü Phân tích trên cơ sở tính trạng [trait-based analysis]
ü Lập bản đồ cách quãng QTL(interval mapping)
ü Kiểm tra phương trình dự đoán đa biến
ü Tính toán epistasis
1.7 Phân tích QTL
Phần lớn những tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi do môi trường là tính trạng di truyền số lượng. Do đó, phân tích những loci của tính trạng số lượng QTL (quantitative trait locus-số ít, quantitative trait loci-số nhiều) đã được phát triển với nhiều mô hình nhằm đáp ứng yêu cầu nghiên cứu (Liu 1998).
Tính trạng số lượng được định nghĩa một cách kinh điển là tính trạng có phân bố liên tục (continuous distribution), tính trạng này được điều khiển bởi nhiều gen, mỗi gen có một ảnh hưởng nhỏ đối với tính trạng mục tiêu.
Bản đồ QTL bao gồm kiến trúc của những bản đồ genome và tìm kiếm mối quan hệ giữa tính trạng với những marker đa hình, minh chứng một QTL định vị kề cận những marker. Di truyền tính trạng số lượng rất phức tạp do với tính trạng đơn gen trong di truyền Mendel, bởi vì nó còn chịu sự tác động rất mạnh của môi trường.
Danh sách những tài liệu tham khảo về bản đồ QTL hiện nay khá phong phú, đặc biệt là công trình của:
ü Lander và Schork (1994)
ü Lander và Zheng (1994)
ü Stuber và ctv. (1992)
ü Tanksley (1993)
ü Weller (1998)
Những tác giả đã sử dụng phép thử T (t-test), phương trình tuyến tính, phương trình đa tuyến, phương trình phi tuyến tính và phép thử cách quãng để xây dựng mô hình.
Thành tựu nổi bật là phần mềm MAPMARKER/QTL của Lander và ctv (1987) QTLSTAT của Liu và Knapp (1992), QGENE của Tanksley và Nelson (1996) đã giúp cho việc nghiên cứu phân tích QTL được diễn giải một cách rõ ràng hơn
Bảng 1: Danh mục những “computer software” liên quan đến phân tích và lập bản đồ QTL […]
1.7.1 Những mô hình về di truyền số lượng
a. Mô hình QTL đơn (single-QTL)
Một trong những mục tiêu của bản đồ QTL là tìm kiếm trong toàn bộ genome nơi định vị của gen mục tiêu thông qua một trắc nghiệm giả định đối với một marker đơn hoặc một vị trí nhất định. Sau đó, người ta sẽ xây dựng nó một model có tính chất “đa QTL” (multiple QTL).
Bảng 2: Mô hình QTL đơn trong quần thể hồi giao (backcross) và F2, nQQ, nQq, và nqq biểu thị kiểu gen của QQ, Qq, và qq
Như vậy, ảnh hưởng tính cộng (a) và ảnh hưởng tính trội (d) đã được biểu thị trong bảng 2 trong mô hình quần thể phân ly F2, và giá trị di truyền trong quần thể hồi giao, với các ảnh hưởng như sau: ảnh hưởng chính, ảnh hưởng tương tác 2 chiều, 3 chiều, 4 chiều và tương tác “i-way”.
b. Mô hình “multiple-locus”
Mô hình di truyền tính trạng số lượng được định nghĩa theo số gen, các ảnh hưởng của gen, tần suất gen, tương tác giữa các gen, tương tác giữa gen x môi trường.
Giả định có n gen điều khiển một tính trạng số lượng nào đó. Hãy xem xét quần thể F2, những ảnh hưởng di truyền có thể xảy ra: ảnh hưởng chính, ảnh hưởng tương tác 2 chiều, 3 chiều, 4 chiều và tương tác “i-way”. Cuối cùng là ảnh hưởng tổng quát.
Bảng 3: Các hệ số thuộc biến số Dummy và ảnh hưởng của gen
1.7.2. Các phương pháp phân tích Marker
a. Phương pháp phân tích marker đơn (SMA = single marker analysis)
Ứng dụng nguyên tắc trong phân tích liên kết gen, chúng ta có thể xác định cách thức của tính chất di truyền marker và vị trí mà nó hiện diện trong genome
ü Gen điều khiển tính trạng số lượng có thể được lập bản đồ giống như bản đồ di truyền của marker
ü Khi những marker phủ trên một đoạn khá lớn của genome, nó sẽ tạo ra khả năng rất tốt để chúng ta tìm ra những gen điều khiển tính trạng số lượng.
ü Nếu các gen và các marker đồng phân ly trong một quần thể di truyền, tương quan liên kết giữa chúng có thể được phát hiện.
Phương pháp phân tích marker đơn là một bước khởi đầu, không những chỉ ra bản đồ QTL, mà còn phân tích được cụ thể các số liệu.
Những khám phá đầu tiên của mô hình được căn cứ trên hàm tuyến tính
Yj = μ+ f(marker j) + εj
Trong đó: Yj là giá trị của tính trạng đối với cá thể thứ j
μ là giá trị trung bình của quần thể
f (marker j) là hàm số của kiểu gen marker
εj là sai số.
Thí dụ như một gen Q định vị gần marker A và tính trạng mục tiêu được điều khiển bởi gen Q có thể được mô phỏng thông qua marker A.
Yj = μ + f (A) + εj
Bài toán là giải đáp “xác suất tin cậy được” của f (A) có chứa giá trị di truyền của kiểu gen Q và giá trị liên kết giữa A và Q
Phương pháp SMA có thể được thực hiện dưới dạng
ü Phép thử t đơn giản
ü Phân tích phương sai
ü Phương trình tuyến tính
ü Phép thử tỉ lệ mô phỏng và ước đoán mô phỏng tối đa
Phương pháp SMA rất đơn giản trong phân tích số liệu và thực hiện các bước tính toán, người ta có thể sử dụng phần mềm SAS để thiết lập mô hình.
- SMA trên quần thể hồi giao
Hình 1: Con lai hồi giao trong SMA
- Phân tích phương sai trong quần thể hồi giao
Bảng 4: Phân tích phương sai SMA điển hình
Phép thử F = MSM / MSG(M)
- Kết hợp hiện tượng phân ly của QTL và marker
Bảng 5: Tần suất kiểu gen QTL hi vọng định vị kế cận marker trong quần thể hồi giao, không có hiện tượng quấn chéo (Liu 1998)
- Phép thử t đơn giản trong quần thể hồi giao
Bảng 6: Phân tích phương sai SMA trong quần thể hồi giao với N là qui mô quần thể con lai, b là số lần lập lại và c là hệ số dự đoán c = N – [n12+ n22] / N
- Mô phỏng trong quần thể hồi giao
Hình 2: Đường phân bố lý thuyết của giá trị tính trạng đối với kiểu gen QTL trong từng kiểu gen marker AA và Aa trên cơ sở quần thể hồi giao. Marker A liên kết với QTL với r = 0,2 (Liu 1998)
Phương pháp tiếp cận theo kiểu mô phỏng (likelihood) được áp dụng trong SMA (Weller 1986). Một marker A nào đó được giả định liên kết với một QTL với tần suất tái tổ hợp r = 0,2. QTL này có một ảnh hưởng di truyền g = 0,5 (μ1 – μ2) = 0,5 σ. Phương sai tính trạng của 2 kiểu gen QTL (QQ và Qq) là σ2. Đối với hai nhóm marker AA và Aa, phân bố đường biểu biễn của giá trị tính trạng là một kết hợp giữa hai đường chuẩn như vậy (Hình 2)
b. Phương pháp SMA trong quần thể F2
Hình 3: Quần thể con lai F2 trong SMA
Bảng 7: Phân tích phương sai SMA điển hình trong quần thể F2.
Bảng 8: Tương phản tuyến tính đối với những kiểu gen của marker trong quần thể F2.
Codominant marker: FM = MSM / MSG(M)
E (tính cộng) = [μ + (1-2r)a + 2r(1-r)d] – [μ – (1-2r)a + 2r(1-r)d] = 2(1-2r)a
E (tính trội) = [μ + (1-2r)a + 2r(1-r)d] – 2{[μ + [1-r)2 +r2]d} + [μ + (1-2r)a + 2r(1-r)d] = 2(1-2r)2 d
Dominant marker: người ta phải dùng lý thuyết giả định H0 = μA- – μaa
E (μA- – μaa) = [μ + 1/3 (1-2r)a + 2/3(1-r+r2)d] – [μ – (1-2r)a + 2r(1-r)d]
= 1/3[4(1-2r)a + 2(1-2r)2d]
1.7.3 Phân tích QTL trên cơ sở bản đồ cách quãng (interval mapping)
Hình 4: Mối quan hệ liên kết giữa một QTL và hai marker kế cận
QTL liên kết với marker A có giá trị tái tổ hợp (recombination fraction) là r1
QTL liên kết với marker B có giá trị tái tổ hợp là r2
Mối quan hệ liên kết có giá trị tái tổ hợp: r = r1 + r2 – 2r1r2
Khi r có giá trị rất nhỏ, r = r1 + r2
Vị trí của QTL được thể hiện bởi một vị trí tương đương với quãng giữa A và B là: ρ = r1/r và 1 – ρ = r2/r
a. Bản đồ cách quãng trong quần thể hồi giao (BC)
Hình 5: Quần thể con lai BC trong phân tích bản đồ cách quãng với 2 marker A và B
Bảng 9: Tần suất hi vọng của QTL và marker trong quần thể BC, không có quấn chéo
Phương pháp mô phỏng bản đồ QTL trên quần thể BC được thức hiện theo hàm số
Sau đó, chúng ta tính giá trị Log (L) (logarith likelihood)
Hình 6: Phân bố lý thuyết của giá trị tính trạng đối với kiểu gen QTL (QQ vq Qq) trong kiểu gen marker (AABB, AABb, AaBB và AaBb), trên cơ sở quần thể BC. Marker A và B liên kết với giá trị r = 0,3 và QTL nghiên cứu định vị giữa hai marker này (Liu 1998)
b. Bản đồ cách quãng trong quần thể F2
Thế hệ F1 biểu thị ưu thế lai giữa hai dòng cận giao AAQQBB x aaqqbb. Bảng 10 cho thấy tần suất hi vọng có được của kiểu gen QTL và marker trong F2 với giả định là không có trao đổi chéo. Tần suất tái tổ hợp giữa marker A và B là r, giữa QTL và marker A là r1.
Phương pháp mô phỏng bản đồ QTL trên quần thể BC được thức hiện theo hàm số:
trong trường hợp “codominant marker”
Bảng 10: Tần suất hi vọng có được của kiểu gen QTL và marker trong F2
LOD score là giá trị chứng minh mức độ có ý nghĩa của phân tích, được tính toán như sau:
LOD1 = log10 L (μ1, μ2, μ3, σ2, r1) – log10 L (μ, σ2)
LOD2 = log10 L (μ1, μ2, μ3, σ2, r1) – log10 L (μ1, μ3, σ2, r1)
LOD3 = log10 L (μ1, μ2, μ3, σ2, r1) – log10 L (μ1, μ2, σ2, r1)
Thông thường bản đồ QTL có ý nghĩa khi giá trị LOD ≥ 3.
1.7.4 Khả năng giải thích về thống kê sinh học của bản đồ QTL
Những yếu tố sau đây có thể ảnh hưởng đến bản đồ QTL:
ü Số gen điều khiển tính trạng và vị trí của nó trong genome
ü Sự phân bố của các ảnh hưởng di truyền và cách thức tương tác giữa các gen
ü Hệ số di truyền của tính trạng mục tiêu
ü Số gen phân ly trong quần thể lập bản đồ
ü Loại quần thể con lai và độ lớn của quần thể
ü Mật độ của bản đồ liên kết gen, số marker phủ trên genome
ü Phương pháp thống kê được ứng dụng, mức độ có ý nghĩa trong phân tích
Hình 7: Tương quan giữa kiểu hình, kiểu gen và môi trường (Xu 1997)
Hình 8: Phát triển quần thể cận giao tái tổ hợp (RILs) thông qua kỹ thuật SSD (single seed descent: thu thập từng hạt trên mỗi cá thể) (McCouch và Doerge 1995)
Trong phương pháp SMA, khả năng thống kê được dựa trên phép thử t (t-test), phân tích phương sai và trắc nghiệm mô phỏng theo dạng tuyến tính
Trong phương pháp bản đồ cách quãng (IMA: interval mapping analysis), khả năng thống kê dựa trên một hệ phương trình tuyến tính với con lai hồi giao, đối thuyết H0 = μ1- μ2= 0 (không có ảnh hưởng QTL trong quãng), trắc nghiệm mô phỏng thông qua giá trị “log likelihood”
Trong phương pháp “multiple QTL”, khả năng thống kê dựa trên lý thuyết mỗi gen là tập họp của {p1, p2, p3,.. pq} ở mức độ tin cậy α, nhằm phát hiện được ít nhất qe QTL, trong đó, qe ≤ qi (Liu 1998)
Hình 9: Thí dụ bản đồ QTL cây lúa trên nhiễm sắc thể số 8. (a) Vị trí và kích thước của một đoạn đồng dạng (homeologous segment) của nhiễm thể 7A lúa mì trên cơ sở cDNA marker chung giữa lúa và lúa mì. (b) Tính trạng cuốn lá (leaf rolling) trong cơ chế thoát khô hạn. (c) Tính trạng chiều dày của rễ. (d) Tính trạng điều tiết áp suất thẩm thấu OA. (e) Số vết bệnh trong tính kháng không hoàn toàn (partial resistance) bệnh đạo ôn. (f) Gen Pi-zb (kháng đạo ôn hoàn toàn. (g) Ngày gieo đến trỗ (xủ lý 10 giờ sáng). (h) Ngày gieo đến trỗ (xử lý 14 giờ sáng). (i) Ngày gieo đến trỗ theo Li và ctv. (j) Ngày gieo đến trỗ theo Xiao và ctv (McCouch và Doerge 1995)
2. Cơ sở di truyền tính chống chịu khô hạn
2.1 Khô hạn
Khô hạn và mặn là hai yếu tố cơ bản làm hạn chế sự tăng trưởng, phát triển và năng suất cây trồng. Trong đó, khô hạn là yếu tố quan trọng bậc nhất ảnh hưởng đến an toàn lương thực của thế giới, và điều này đã từng xảy ra trong quá khứ. Nước phục vụ cho nông nghiệp không phải là tài nguyên vô tận, bên cạnh đó sự tăng dân số kèm theo sự phát triển đô thị sẽ làm gia tăng nhu cầu nước phục vụ đời sống và cho phát triển công – nông nghiệp. Do đó, sự khan hiếm nước phục vụ nông nghiệp là vấn đề đang được dự báo rất cấp thiết trên qui mô toàn cầu. Hiện nay, nước phục vụ nông nghiệp chiếm 70% nguồn nước phục vụ dân sinh của toàn thế giới.
Theo thống kê, để sản xuất 1kg lúa, người ta cần đến 5m3 nước. Nhiều quốc gia như Ai Cập, Nhật Bản, Úc đã cố gắng cải tiến nhằm nâng cao hiệu qủa sử dụng nước, giảm xuống 1,3 m3/kg lúa. Ở Trung Quốc, các nhà chọn giống đang thử nghiệm mô hình canh tác lúa trên đất thoáng khí, với thuật ngữ “aerobic rice”, khác với lúa nước truyền thống. Bộ rễ lúa sẽ phát triển như cây trồng cạn, với chế độ tưới cải tiến, nhằm tiết kiệm nước tối đa.
Khô hạn được xem như một trong những hậu quả nghiêm trọng do sự suy giảm của nguồn nước. Do vậy, người ta đã qui định ngày 22 tháng 3 hàng năm là Ngày NướcThế Giới. Hiện nay, mức đảm bảo nước trung bình cho một người trong một năm đã giảm từ 12.800 m3/người vào năm 1990 xuống còn 10.900 m3 /người vào năm 2000 và có khả năng chỉ còn khoảng 8.500 m3/người vào năm 2020. Theo Hội Nước QuốcTế (IWRA), tiêu chuẩn công nhận quốc gia có mức bảo đảm nước cho một người nhỏ hơn 4000 m3/năm, được xem như thiếu nước và nhỏ hơn 2000 m3/năm, thuộc loại hiếm nước. Kết quả đánh giá của chương trình KC12 ở Việt Nam cho thấy: tổng lượng nước cần dùng cả năm của nước ta chiếm 8,8% tổng lượng dòng chảy, năm 1999, tăng lên 12,5% trong năm 2000, và được dự báo sẽ tăng 16,5% vào năm 2010. Tổng lượng nước phục vụ tưới trong nông nghiệp của Việt Nam: 41 km3 năm 1985, tăng lên 46,9 km3 năm 1999, và năm 2000 là 60 km3. Lượng nước cần dùng cho mùa khô sẽ tăng lên 90 km3 vào năm 2010, chiếm 54% tổng lượng nước có thể cung cấp.
Xét trên qui mô toàn cầu, nhiệt độ trái đất nóng lên sẽ có khả năng làm mất 1/3 nguồn nước đang sử dụng của thế giới trong 20 năm tới, như dự báo của Liên Hợp Quốc. Khủng hoảng thiếu nước trên thế giới hiện nay được nhận định không chỉ do nước quá ít so với nhu cầu mà còn do quản lý nguồn nước kém. Hàng năm có 2,2 triệu người chết do các căn bệnh liên quan đến nguồn nước ô nhiễm và điều kiện vệ sinh kém, với 12.000 km3 nước sạch hiện bị ô nhiễm nghiêm trọng. Do đó, từ năm 2000 trở đi, các dự án quốc tế về nông nghiệp thuộc hệ thống CGIAR đã nhấn mạnh đến giống cây trồng chống chịu khô hạn, nước sạch cho nông thôn, đô thị, xem những nội dung này là một ưu tiên đặc biệt.
Các trung tâm nghiên cứu trên thế giới được FAO phân công phụ trách những cây trồng liên quan đến chống chịu khô hạn là:
ü IITA phụ trách nghiên cứu đậu cowpea ở Sahel, đậu tương và bắp ở Dry Savana
ü ICRISAT phụ trách nghiên cứu cao lương, kê, đậu chickpea, đậu phộng và đậu pigeonpea ở Ấn Độ và Sahel
ü CIAT phụ trách nghiên cứu các loại đậu ở Mexico, Trung Mỹ và Đông bắc Brazil
ü IRRI phụ trách nghiên cứu lúa ở Bangladesh, Đông Ấn Độ, Thái Lan và Indonesia
ü CIP phụ trách nghiên cứu khoai tây ở Trung Quốc. Ấn Độ, Nam Phi, Kazakhstan, Afghanistan
ü CIMMYT phụ trách nghiên cứu lúa mì ở Trung Á, Tây Á, Bắc Phi, bắp ở vùng cận Sahara
2.2 Phương pháp nghiên cứu về di truyền tính chống chịu khô hạn
Những phương pháp nghiên cứu về di truyền tính chống chịu khô hạn bao gồm:
- Thứ nhất là phương pháp phân tích sự đóng góp của các tính trạng có liên quan, với mô hình QTL (quantitative trait loci). Phương pháp tiếp cận này phù hợp với hầu hết các loài cây trồng chủ yếu như cây lúa, nhờ bản đồ di truyền với nhiều marker phân tử DNA phủ kín trên nhiễm sắc thể. Hầu hết các nghiên cứu về tính trạng chống chịu khô hạn đều quan tâm đánh giá các tính trạng có liên quan với đến sự sống và phát triển của. cây trồng trong điều kiện khô hạn. Phương pháp phân tích di truyền phân tử đã giúp cho nội dung ấy đạt hiệu qủa cao hơn, trong khi thực hiện trên từng tính trạng, trước khi chúng ta xem xét sự sống và phát triển của cây. Việc đánh giá kiểu hình của những tính trạng riêng biệt ấy là vô cùng quan trọng, giống như việc đánh giá kiểu hình của sự đáp ứng cây trồng trong điều kiện được kiểm soát ở nhà lưới hay phòng thí nghiệm, trước khi chúng ta đánh giá ngoài đồng ruộng. Một sự liên kết vô cùng chặt chẽ đã được chứng minh, đó là thực hiện các bước trong qui trình MAS (chọn giống nhờ marker phân tử).
- Thứ hai là sáng tạo ra một kiểu biến dị mới có chức năng được hiểu biết cặn kẽ trong phản ứng của cây trồng khi bị stress do khô hạn, thông qua kỹ thuật chuyển nạp gen. Phương pháp chuyển nạp gen cho thấy đó là phương tiện nhiều tiềm năng để gắn vào cây mục tiêu một phổ rất rộng của các gen với khả năng điều tiết một cách linh hoạt ở vị trí “up” hoặc “down” trong quá trình biến dưỡng kết hợp với hiện tượng đáp ứng khi cây bị stress do khô hạn. Nhưng phương pháp chuyển nạp với một gen hay một nhóm gen trong một lộ trình đặc biệt nào đó có thể không thích ứng trong điều kiện chống chịu khô hạn, bởi vì các sản phẩm di truyền điều khiển tính chống chịu khô hạn xuất phát từ rất nhiều lộ trình khác nhau (Ingram và Bartels 1996). Thông thường, nhiều protein hoặc những phân tử “osmolyte” có trọng lượng phân tử thấp, đóng vai trò điều tiết áp suất thẩm thấu, sẽ được tích tụ trong khi bị stress do khô hạn. Người ta chưa hiểu rõ: yếu tố nào chi phối hiện tượng thay đổi rất nhiều và đóng góp tích cực vào tính chống chịu khô hạn. Phương pháp chuyển nạp gen được xem như rất có ích nhưng nó vẫn chưa cho chúng ta biết các thông tin đáng giá.
- Thứ ba là xác định các gen ứng cử viên (candidate genes) đối với tính chống chịu stress do khô hạn, hoặc mặn với những phát triển không ngừng của kỹ thuật chuyển nạp gen, bên cạnh những thành tựu về công nghệ phân lập gen (gene isolation) và thao tác gen (gene manipulation)
2.3 Xác định tính trạng thành phần trong chống chịu khô hạn
Sự thể hiện tính chống chịu khô hạn được quan sát thông qua những tính trạng cụ thể như hình thái rễ cây, lá, chồi thân, phản ứng co nguyên sinh, bao phấn, quá trình trỗ bông, v.v.. Những tính trạng như vậy được gọi là tính trạng thành phần (component traits). Bảng 11 cho chúng ta khái niệm về tính trạng thành phần và các loci tính trạng số lượng (QTL) có liên quan đến tính chống chịu khô hạn của một vài cây trồng.
Bảng 11: Các loci tính trạng số lượng (QTL) liên quan đến tính chống chịu khô hạn của một số loài cây trồng (Reddy và ctv. 1999)
Người ta nhận thấy có sự giống nhau về cơ bản và một vài khác biệt nhỏ về cơ chế chống chịu khô hạn, sự cấu thành năng suất của nhiều loài cây trồng khác nhau. Sự giống nhau về cơ chế chống chịu hạn ở mức độ phân tử rất rõ ràng so với sinh lý học và hình thái học. Chúng ta có thể nghiên cứu từ một cây rồi suy diễn đối với nhiều cây khác (Reddy và ctv. 1999)
Hầu hết các nghiên cứu về marker phân tử đều quan tâm đến những thành phần rất đặc biệt trong sự kiện chống chịu khô hạn, đó là
ü Khả năng phát triển của rễ cây sâu xuống tầng đất bên dưới,
ü Tính trạng phun râu và tung phấn với thời gian cách quãng được xác định (ASI = được viết tắt từ chữ anthesis to silking interval)
ü Sự điều tiết áp suất thẩm thấu (OA = được viết tắt từ chữ osmotic adjustment)
ü Hiện tượng biến dưỡng ABA (abscisic acid)
ü Hiện tượng nông học WUE (water use efficiency: hiệu quả sử dụng nước)
Nhiều nghiên cứu khác còn đề cập đến năng suất và thành phần cấu tạo năng suất. Do đó, người ta đã cố gắng xác định vị trí các QTL cho cả tính trạng có liên quan đến chống chịu khô hạn và năng suất, cũng như thành phần năng suất.
Quần thể được dùng trong phân tích bản đồ QTL thay đổi với nhiều thế hệ khác nhau. Rất hiếm khi, QTL được phát hiện trong một quần thể của những cặp lai khác nhau (Reddy và ctv. 1999). Người ta thường gặp nhiều khó khăn khi so sánh kết qủa ghi nhận được từ quần thể đơn bội kép (DH) với quần thể cận giao tái tổ hợp (RILs), hoặc quần thể chọn giống nào đó. Người ta cũng gặp khó khăn khi so sánh kết qủa của những quần thể có độ lớn khác nhau (số dòng con lai được sử dụng khác nhau, từ vài chục dòng đến hàng trăm dòng con lai)
Số QTL được tìm thầy đối với tính trạng chống chịu khô hạn thường thay đổi từ 1 đến 4 đối với một tính trạng thuộc thành phần trong sự kiện chống chịu hạn, và những QTL này thường trãi rộng trên toàn bộ genome với nhiều nhóm liên kết gen. Thí dụ, tính trạng WUE (hiệu qủa sử dụng nước) được tìm thấy với rất ít QTL, từ 4 đến 5 trong genome cây đậu nành (Milan và ctv 1998).
Trong một vài trường hợp, có những QTL định vị trên cùng một nhóm liên kết gen, điều khiển nhiều tính trạng quan trọng như khả năng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA), khả năng chống chịu sự thủy phân, chúng liên kết với tính trạng hình thái học của rễ lúa (Lilley và ctv. 1996). Biến thiên kiểu hình đối với từng tính trạng xét trên mỗi vị trí QTL xoay quanh giá trị 10%. Trong trường hợp ngoại lệ, QTL đối với tính trạng chiều dài rễ ở giai đoạn 28 ngày tuổi biến thiên 30% (Price và Thomas 1997).
Mối quan hệ giữa năng suất và QTL thường cho kết qủa âm tính trong vài trường hợp, nhưng đối với tính trạng ASI, kết qủa chống chịu hạn không đối kháng với năng suất (Ribaut và ctv.1996). Những QTL đối với tính trạng ASI có tính ổn định nhiều năm, trong điều kiện mức độ stress khác nhau, sẽ được xem như là những ứng cử viên trong chiến lược áp dụng MAS.
3. Bản đồ QTL các tính trạng hình thái quan trọng của cây chống chịu khô hạn
3.1 Bản đồ QTL đối với tính trạng rễ lúa.
Hệ thống rễ phát triển tốt là một tính trạng vô cùng quan trọng giúp cây trồng chống chịu khô hạn (cơ chế thoát hạn = drought avoidance mechanism). Người ta đã sử dụng quần thể đơn bội kép (DH) của cặp lai IR64 x Azucena tại Viện Lúa Quốc Tế (IRRI). Sau đó Shen và ctv. (1999) đã phát triển quần thể gần như đẳng gen (NIL) của IR64 được du nhập với những QTL chủ lực. Các tác giả đã ghi nhận bốn đoạn trên nhiễm sắc thể số 1, 2, 7, và 9 là nơi định vị các QTL chủ lực trong phân tích chọn lọc từng QTL mục tiêu (hình 10, Bảng 12). Có 4 dòng DH với hiện tượng tổ hợp alen riêng rẽ tại 4 đoạn nhiễm sắc thể này, trong đó có ít hơn 50% alen của Azucena. Bốn dòng này đã được chọn làm “donor” (vật liệu cho gen chống chịu). Những dòng như vậy được lai lui với IR64 cho đến khi thu hoạch quần thể BC3F1, rồi sau đó cho chúng tự thụ bình thường. Áp dụng MAS đối với 4 đoạn nhiễm sắc thể như vậy để hoàn thiện qui trình chọn lọc từ BC1F1 đến BC3F2. Tất cả con lai của BC3F2 mang những alen của donor, định vị tại ít nhất một trong bốn khu vực mục tiêu. Những cây mang hai đoạn mục tiêu trở lên đã được xác định. Biến thiên kiểu hình đối với nhiều tính trạng không phải là mục tiêu cũng được quan sát ở BC3F2, người ta kết luận rằng có sự thể hiện về di truyền từ thế hệ trước sang thế hệ sau trong qúa trình du nhập gen (introgression) (Shen và ctv. 1999). Điều tra cơ bản phần còn lại của genome cho thấy những cây của BC3F2 có một phần rất nhỏ của những alen thuộc Azucena định vị trên những vùng không phải mục tiêu, gần với giá trị lý thuyết # 3%. Người ta thực hiện nhiều cặp lai giữa các cây BC3F2 mang những đoạn mục tiêu của vật liệu cho gen điều khiển rễ lúa phát triển tốt, để loại trừ ảnh hưởng di truyền theo kiểu “genetic drag” và ảnh hưởng các QTL mục tiêu khác nhau chồng lấp theo hình tháp (Shen và ctv. 1999)
Bảng 12: Các dòng đơn bội kép (DH) được chọn lọc để thực hiện hồi giao (Shen và ctv. 1999)
Hình 10: Bản đồ di truyền QTL trên cơ sở quần thể đơn bội kép (DH) của IR64/ Azucena về tính trạng rễ lúa mọc sâu (Shen và ctv. 1999)
Bảng 13: Những QTL đối với hình thái của rễ lúa (Shen và ctv. 1999)
DWR: trọng lượng rễ lúa dài
3.2 Bản đồ QTL đối với tính trạng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA).
Thành tựu của công nghệ sinh học trong việc thực hiện xây dựng bản đồ di truyền phân tử cho phép chúng ta xem xét những tính trạng di truyền phức tạp như tính chống chịu khô hạn và năng suất (Zhang và ctv. 1999). Tại Đại học Texas Tech, nhóm tác giả này đã thực hiện bản đồ di truyền QTL đối với 2 tính trạng quan trọng liên quan đến sự kiện chống chịu khô hạn, đó là: khả năng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA), và những tính trạng hình thái của rễ lúa.
Hiện nay, người ta biết rằng: nghiên cứu sinh lý học đã tìm ra 3 hợp phần chính đóng góp vào sự kiện chống chịu khô hạn của cây lúa: (1) khả năng ăn sâu của rễ xuống tầng đất phía dưới, (2) khả năng điều tiết áp suất thẩm thấu (cơ chế chống chịu), giúp cây bảo vệ sinh mô không bị tổn hại do mất nước, (3) khả năng kiểm soát sự mất nước ở bên ngoài khí khổng của lá (Nguyễn và ctv. 1997)
Hiện tượng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA) là một hợp phần quan trọng trong sự kiện chống chịu khô hạn. Khả năng OA của cây giúp nó tích lũy chất hòa tan một cách chủ động trong tế bào, khi cây bị khô hạn. Tính trạng OA kết hợp với tính trạng năng suất ổn định trong điều kiện bị stress do khô hạn đã được quan sát ở lúa mì và cao lương, nhưng hiện tượng này không được ghi nhận trên cây lúa (Zhang và ctv. 1999).
Quần thể lúa đã được sử dụng trước đây để lập bản đồ QTL tính trạng OA là:
ü Quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) của tổ hợp lai CO39 / Moroberekan, với 1 QTL (Lilley và ctv. 1996)
ü Quẩn thể đơn bội kép (DH) của tổ hợp lai CT9993 / IR62266, với 4 QTL (Zhang và ctv. 1999)
Quần thể lúa đã được sử dụng để lập bản đồ QTL tính trạng chống chịu sự thủy phân (viết tắt DT từ chữ dehydration tolerance) là quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) của tổ hợp lai CO39 / Moroberekan, với 5 QTL (Lilley và ctv. (1996)
Quần thể lúa đã được sử dụng để lập bản đồ QTL tính trạng tích lũy ABA là quần thể F2 của tổ hợp lai IR20 / 63-83, với 10 QTL (Quarrie và ctv. 1997)
Một yếu tố vô cùng quan trọng làm hạn chế việc thực hiện bản đồ QTL của tính trạng OA là thiếu những qui trình đánh giá kiểu hình nhanh, với một số lượng lớn các vật liệu thí nghiệm. Gần đây, có 3 qui trình thường được sử dụng để xác định OA so sánh với phương pháp tái tạo hiện tượng hấp thụ nước đã được đề xuất trong trường hợp cây lúa (Babu và ctv 1999).
Quẩn thể đơn bội kép (DH) của tổ hợp lai CT9993 / IR62266, với 154 dòng con lai được chọn. Nhóm tác giả đã sử dụng 145 RFLP, 153 AFLP và 17 microsatellite để thiết lập bản đồ QTL. Tổng số là 315 marker.
Đánh giá kiểu gen còn được thực hiện trên quần thể RIL của tổ hợp lai IR58821-23-B-2-1 / IR52561-UBN-1-12, với 166 dòng con lai được chọn. Tổng số 383 AFLP và 106 RFL đã được sử dụng để thiết lập bản đồ QTL (Zhang và ctv. 1999).
Một QTL đã được xác định trên nhiễm sắc thể số 8, định vị giữa 2 marker RG1 và
RG978 (Hình 11), với tần suất biến thiên kiểu hình 32-34%. QTL này nằm trong vùng đồng dạng với nhiễm sắc thể số 7 của lúa mì
Hình 11: Bản đồ QTL trên cơ sở quần thể DH của tổ hợp lai CT9993-5-10-1-M / IR62266-42-6- 2. ICGY: năng suất tại Israel, điều kiện bình thường. ISGY: năng suất tại Israel, điều kiện khô hạn. OA: điều tiết áp suất thẩm thấu. RD: độ sâu của rễ. RPF: lực nhổ rễ. RPI: chỉ số rễ phát triển chiều sâu. YRI: chỉ số năng suất, TCGY : năng suất tại Thái Lan. TH: độ dầy của rễ (Zhang và ctv. 1999)
3.3 Bản đồ QTL tính trạng biểu hiện màu xanh của cao lương.
Trong cây cao lương, khô hạn xảy ra trước và sau khi trỗ bông gây ra hiện tượng chín sớm trong tính trạng mức độ hóa già của lá (senescence). Cây mất màu xanh nhanh chóng, đỗ ngã, và thất thu năng suất. Hơn 80% cao lương ưu thế lai được trồng tại Mỹ dưới điều kiện không có nước tưới, nhưng hầu hết các giống này đều có khả năng kháng hạn ở giai đoạn trước khi trỗ bông, hiện tượng như vậy được gọi với thuật ngữ là “stay-green trait” (tạm dịch là tính trạng biểu hiện màu xanh, tính trạng kéo dài thời gian hóa già, viết tắt là SGT). Tính trạng như vậy là một cơ chế kháng hạn giúp cho cây cao lương chống lại sự lão hóa sớm dưới điều kiện khắc nghiệt của ẩm độ đất hạn chế trong suốt qúa trình sau khi trỗ. Subudhi và ctv (1999) đã xác định 4 QTL đối với tính trạng SGT này, trong quần thể cận giao tái tổ hợp của tổ hợp lai B35 / Tx7000, với 98 dòng được chọn ở F7. Ba QTL chủ lực của tính trạng SGT được xác định trên những thí nghiệm ngoài đồng, đóng góp 46% biến thiên kiểu hình. Bốn QTL của tính trạng SGT định vị trên 3 nhóm liên kết gen. Ba QTL: Sgt 1, Sgt 2, và Sgt 3 đóng góp vào tần suất biến thiên kiểu hình là 20%, 30% và 16%, theo thứ tự. QTL thứ tư là Sgt 4 được xác định trong năm 1994, giải thích 13% sự biến thiên kiểu hình. Đối với tất cả QTL này, những alen SGT đều do giống mẹ B35 cung cấp. Các tác giả dự định sẽ thiết lập bản đồ vật lý các nơi định vị của những QTL như vậy để có những hiểu biết rõ ràng hơn về di truyền tính chống chịu hạn của cao lương. Hiện kết qủa nghiên cứu đã áp dụng MAS để xác định sự du nhập các gen Sgt vào các dòng con lai có triển vọng (Subhudi và ctv. 1999).
Một cặp lai khác B35 / Tx430 cũng được thành lập quần thể RIL, với 96 dòng được chọn. Bảy QTL của tính trạng SGT được xác định, trong đó có 3 QTL chủ lực Sgt A, Sgt D và Sgt G. Những QTL này định vị trên 3 nhóm liên kết gen, đóng góp 42% biến thiên kiểu hình. Bốn QTL thứ yếu (Sgt B, Sgt I-1, Sgt I-2, Sgt J) đóng góp 25% biến thiên kiểu hình của tính trạng SGT (Subudhi và ctv. 1999).
3.4 Bản đồ QTL đối với các tính trạng hình thái quan trọng khác.
Các tính trạng số lượng của cây lúa giai đoạn mạ: tổng số rễ, thể tích rễ, số chồi, tỉ lệ rễ / chồi, chiều dài rễ tối đa, điểm chống chịu khô hạn (1-5), bề dày của rễ, chiều cao cây mạ, trọng lượng rễ khô, độ cuốn lại của lá lúa, đã được thiết lập bản đồ QTL (Shashidhar và ctv. 1999). Người ta sử dụng quần thể đơn bội kép từ cặp lai IR64 / Azucena, với 56 dòng được chọn. Tổng số RFLP marker biểu hiện đa hình trong điều tra ở bố mẹ, được sử dụng là 175 marker, bao phủ 2.005 cM, với khoảng cách trung bình là 11,5 cM giữa hai marker.
QTL đối với tính trạng chiều cao cây định vị giữa marker RZ730-RZ801 trên nhiễm sắc thể số 1. Vị trí này tương ứng với gen sd-1 điều khiển tính trạng nữa lùn (semidwarf).
Hình 12 và bảng 14 cho thấy 15 QTL khác được tìm thấy ở cả hai giai đoạn phát triển, trong đó có 4 QTL thể hiện khá phổ biến
Hình 12: Bảng đồ QTL của các tính trạng hình thái và sinh lý quan trọng liên quan đến chống chịu khô hạn (Shashidhar và ctv. 1999).
Bảng 14: Những QTL giả định trong 2 giai đoạn tăng trưởng của cây lúa: 65 ngày sau khi gieo (DAS) có nước tưới bình thường, và 85 DAS dưới điều kiện bị khô hạn từ ngày 65 trở đi (Shashidhar và ctv. 1999).
Các tác giả còn ghi nhận 21 QTL đối với những tính trạng khác trong điều kiện bị stress do khô hạn. Mặc dù có 2 QTL đối với tính trạng chiều cao định vị ở nhiễm thể số 1 và 3, khá phổ biến, nhưng không có một loci nào đối với tính trạng hình thái học của rễ được ghi nhận phổ biến giữa hai giai đoạn phát triển. Sự không có mặt của những QTL phổ biến đối với tính trạng hình thái của rễ giữa hai giai đoạn phát triển (65 ngày đầu có nước, và từ ngày 65 – đến ngày 85: khô hạn) cho thấy sự hiện diện của những cơ chế di truyền cùng tồn tại song song, cùng khởi động ở các giai đoạn tăng trưởng khác nhau, dưới điều kiện nước tưới khác nhau (Shashidhar và ctv. 1999). Thể tích rễ và tổng số rễ trên một cây giảm có ý nghĩa về mặt thống kê dưới điều kiện bị stress do khô hạn, trong khi đó chiều dài rễ tối đa và chiều cao cây khác biệt không có ý nghĩa.
Nguyễn Thị Lang & ctv.(2008) lập được bản đồ QTL khô hạn với các marker liên kết tập trung quần thể với 232 markers chiều dài 2.553.70cM phủ trên 12 nhiễm sắc thể, trung bình là 10.97cM
Chromosome Số marker Chiều dài bản đồ ( C.M) Trung bình 1 24 355.5 14.81 2 25 327 13.08 3 19 221.8 11.67 4 18 187.9 10.43 5 17 183.2 10.77 6 20 120.9 6.045 7 18 189 10.5 8 17 180.9 10.64 9 20 290.4 16.13 10 15 133.3 8.88 11 18 177.2 9.84 12 21 186.6 8.88 Tổng cộng 232 2.553.7 10.97
Bảng 15: Bản đồ di truyền của gen chống chịu khô hạn (Nguyễn Thị Lang & ctv. 2008)
Hình 13: Bản đồ di truyền của gen chống chịu khô hạn trên 12 nhiễm sắc thể (Nguyễn Thị Lang & ctv. 2008).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
- Babu RC, MS Pathan, A Blum, HT Nguyen. 1999. Comparision of measurement methods of osmotic adjustment in rice cultivars. Crop Sci 39:150-158
- Basten CJ, BS Weir, ZB Zeng. 1994. ZMAP- A QTL cartographer. Proceedings of the 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production 22:65-66 Bonierbale MW, RL Plaister, SD Tanksley. 1998. Genetics 120: 1095-1103
- Botstein D, RL White, M Skolnick, RW Davis. 1989. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism. Ann J Genet 32:314
- Bùi chí Bửu, Nguyễn Thị Lang. 2003. Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với thiệt hại do môi trường của cây lúa. Nxb nông nghiệp tpHCM.
- FAO. 2002. FAO statistics, sentayho.com.vn/(2002)
- Ingram J, D Bartels. 1996. The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Plant Cell Rep. 15:963-968
- Kilian A, J Chen, F Han, B Steffenson, A Kleinhofs. 1997. Plant Mol Biol 35: 187-195 Knapp SJ, WC Bridges, BH Liu. 1992. Mapping quantitative trait loci using nonsimultaneous and simultaneous estimators and hypothesis tests. In: JS Beckmann and TS Osborn (eds.), Plant Genomes: Methods for genetcis nad physical mapping, pp. 209-237.
- Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands
- Lander ES, P Green. 1987. Construction of multilocus genetic linkage maps in human. Proc Natl Acad Sci USA 84:2363-2367
10. Lander ES, D Botstein. 1989. Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121:185-199
11. Li Z. 1999. DNA markers and QTL maping in rice. In: Genetic Improvement of Rice for Water-Limited Environments. (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy. IRRI, Philippines. P. 157-172.
12. Lilley JM, MM Ludlow, SR McCouch, JC O’Toole. 1996. Locating QTL for osmotic adjustment and dehydration tolerance in rice. J Exp Bot 47:1427-1436
13. Liu BH. 1998. Statistical genomics: Linkage, mapping and QTL analysis. CRC Press, New York, 611pp.
14. Manly KF, EH Cudmore Jr. 1996. New versions of MAP Manager genetic mapping software. Plant Genome IV (Abs.) p”105
15. Milan MAR, DA Aswey, HR Boerma. 1998. An additinal QTL for water-use-efficiency in soybean. Crop Sci. 38:390-393
16. McCouch SR, RW Doerge. 1995. QTL mapping in rice. Plants 11(12): 482-487
17. Nelson JC. 1987. QGENE: software for marker-based genomic analysis and breeding Tanksley SD, JC Nelson. 1996. Advanced backcross QTL analysis: a method for the simultaneous discovery and transfer of valuable QTLs from unadapted germplasm into elite breeding. Theor Appl Genet 92:191-203
18. Nguyen HT, RC Babu, A Blum. 1997. Breeding for drought tolerance in rice (Oryza sativa): physiology and molecular genetic considerations. Crop Sci 37:1426-1434
19. Nguyễn Thị Lang & ctv. 2008. Tạo giống lúa chống chịu hạn bằng phương pháp dấu chuẩn phân tử.
20. Price AH, Thomas. 1997. Quantitative trait loci associated with stomatal conductance, leaf rolling and heading date mapped in upland rice (Oryza sativa L.). New Phytol 137:83-91
21. Reddy AR, V Ramanathan, N Seetharama, S Bajaj, R Wu. 1999. Genetic improvement of ricefor drought and salt tolerance: molecular breeding and transgenic strategies. In: Genetic Improvement of Rice for Water-Limited Environments. (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy. IRRI, Philippines. P. 135-155
22. Ribaut JM, C Jang, D Gonzales de Leon, GO Edmeades, DA Hoisington. 1997. Identification of quantitative trait loci under drought conditions in tropical maize. 2. Yield components and marker-assisted selection strategies. Theor Appl Genet 94:887-896
23. Ribaut JM, DA Hoisington, JA Deutsch, C Jang, D Gonzales de Leon. 1996. Identification of quantitative trait loci under drought conditions in tropical maize. I. Flowering parameters and anthesis-silking interval. Theor Appl Genet 92:905-914
24. Shashidhar HE, GS Hemamalini, S Hittalmani. 1999. Molecular marker-assisted tagging of morphological and physiological traits at the peak vegetative stage: two constrasting moisture regimes. In: Genetic Improvement of Rice for Water-Limited Environments. (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy. IRRI, Philippines. P. 239-256
25. Shen L, B Courtois, K McNally, SR McCouch, Z Li. 1999. Developing nera-isogenic lines of IR64 introgressed with QTLs for deeper and thicker roots through marker-aided selection. In: Genetic Improvement of Rice for Water-Limited Environments. (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy. IRRI, Philippines. P. 275-289
26. Subudhi PK, GB Magpantay, DT Rosenow, HT Nguyen. 1999. Mapping and marker-assisted selection to improve the stay-green trait for drought tolerance in sorghum. In: Genetic Improvement of Rice for Water-Limited Environments. (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy. IRRI, Philippines. P. 183-191
27. Terwilliger JD, J Ott. 1994. Handbook og human genetic linkage. The Johnson Hopkins University Press, Baltimore van Ooijen, C Maliepaard. 1996. MAPQTL version 3.0: Software for the calculation of QTL position on genetic map. Plant Genome IV (Abs.) p.105
28. Weller JI. 1986. Maximum likelihood techniques for the mapping and analysis of quantitative trait loci with the aid of genetic markers. Biometrics 42:627-640
29. Xu Y. 1997. Quantitative trait loci: separating, pyramiding, and cloning. Plant Breeding Reviews 15. Cornell University, NY 14853-1902, USA
30. Zeng ZB. 1994. Precision mapping of quantitative trait loci. Genetics 136:1457-1468
31. Zhang J, HG Zheng, ML Ali, JN Triparthu, A Aarti, MS Pathan, AK Sarial, S Robin, Thuy Thanh Nguyen, RC Babu, Bay duy Nguyen, S Sarkarung, A Blum, Henry T Nguyen. 1999. Progress on the molecular mapping of osmotic adjustment and root traits in rice. In: Genetic Improvement of Rice for Water-Limited Environments. (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy. IRRI, Philippines. P. 307-317
